PTPRN在人类胶质瘤中的表达和促肿瘤作 [复制链接]

FrontiersinOncology

IF：6.

Sep7

胶质瘤约占所有恶性脑肿瘤的50%。胶质瘤患者的预后与肿瘤的体积、WHO分级和位置有关。目前临床上主要采用放疗、化疗、基因治疗等治疗方法。然而，由于放化疗耐药性，高级别胶质瘤患者的中位生存时间短于12个月。因此，迫切需要研究胶质瘤发生发展的分子机制，以探索诊断和治疗胶质瘤的有效方法。

蛋白酪氨酸磷酸酶受体N（PTPRN）位于人类染色体2q35带。PTPRN主要表达于内分泌细胞、自主神经系统神经元和大脑神经内分泌神经元，包括胰腺、垂体、肾上腺髓质、杏仁核和下丘脑，因为它们都含有神经分泌颗粒。PTPRN是一种I型跨膜蛋白，具有非活性蛋白酪氨酸磷酸酶(PTP)结构域。PTPRN参与神经内分泌过程，如生物生成、运输和/或调控外分泌等。ToriiS等人证明，PTPRN对各种神经内分泌细胞的分泌途径的调节有重要影响，可能是通过调节激素含量。糖尿病相关的基因筛选实验表明，PTPRN在糖尿病的发生和发展中起着重要作用。MziautH证明，PTPRN通过与STAT5结合增加分泌颗粒基因的转录。

我们分析了胶质瘤患者的预后并观察了PTPRN对胶质瘤细胞表型的影响。为了明确PTPRN在胶质瘤细胞中的作用机制，我们下调了PTPRN，检测了胶质瘤细胞中的通路变化，并确定了与PTPRN有关的影响通路变化的可能因素。

1.本研究回顾性分析了57例脑胶质瘤患者的临床和预后信息。

2.采用“基因表达谱交互分析(GEPIA)”和“人类蛋白图谱”对TCGA数据库进行分析；免疫组织化学分析；细胞培养和转染；RT-qPCR；免疫印迹分析；CCK-8细胞活性检测试剂盒；集落形成实验；细胞愈合实验；极限稀释分析（测定胶质瘤干细胞的自我更新能力）；RNA-seq；共同免疫沉淀（Co-IP）和液相色谱-串联质谱（LC-MS/MS）分析；动物实验。

1.PTPRN高表达预示高级别胶质瘤预后不良

基于TCGA数据库的PTPRN表达的生存分析显示，PTPRN高表达预示高级别胶质瘤预后不良(图1B)。我们的临床和实验结果与数据库分析结果一致(图1C)。以平均表达评分5.28为切分点，将PTPRN的表达水平分为低(0-4分)和高(6-12分)两组(图1A)。PTPRN高表达患者的总生存期(OS)短于PTPRN低表达患者。单因素分析显示，PTPRN、MGMT、VEGF水平及WHO分级与胶质瘤患者的预后相关。此外，PTPRN的表达是影响胶质瘤患者预后的独立因素(图1D)。此外，我们发现PTPRN与MGMT呈正相关;而PTPRN水平与性别、年龄、KPS评分、肿瘤直径、VEGF等临床病理指标无相关性(表1)。

2.下调PTPRN可减少胶质瘤细胞的增殖和迁移

转染PTPRN-shrna后，通过RT-qPCR和免疫印迹分析检测PTPRN水平(图2A,B)。CCK8和集落形成试验的结果表明，敲除PTPRN可降低U87细胞的增殖水平(图2C,D)。在低表达PTPRN的U87细胞中，迁移受到抑制(图2E)。在PTPRN敲除组中，胶质瘤干细胞频率降低(图2F)。通过免疫印迹分析检测上皮-间质转化（EMT）相关的标志物，结果显示，N-cadherin和Snail的表达遵循PTPRN的趋势。然而，在PTPRN敲除组中,E-cadherin水平升高(图2G)。

3.PTPRN过表达诱导胶质瘤细胞增殖和迁移

MTS和集落形成实验结果表明，上调PTPRN可诱导U细胞增殖(图3A-D)。在PTPRN高表达的U细胞中，其迁移被诱导（图3E）。在PTPRN过表达组，胶质瘤干细胞频率降低(图3F)。通过免疫印迹分析检测上皮-间质转化（EMT）相关的标志物，发现N-cadherin和Snail的表达遵循PTPRN的趋势。然而，过表达PTPRN后，E-cadherin的水平有所下降（图3G）。

4.PTPRN基因敲除对U87胶质瘤细胞转录组的影响

通过RNA-seq确认胶质瘤中PTPRN功能的通路。Foldchange≥2.0和FDR≤0.用于鉴别差异基因(图4A)。然后采用KEGG法对差异基因进行分析。PI3K/AKT通路也与PTPRN的变化相关(图4B)。火山图分析显示了表达改变的基因数量(图4C)。同时进行了GO分析，将差异基因分为生物过程、细胞组分和分子功能三组(图4D)。GSEA也显示PIK3/AKT通路与PTPRN的变化相关(图4E)。

5.在小鼠移植瘤模型中，PTPRN敲除降低肿瘤生长

通过生物发光成像测量肿瘤体积(图5A)。PTPRN敲除小鼠的肿瘤体积明显减小(图5B)。MRI也显示PTPRN的下调抑制了肿瘤的生长(图5C)。采用Kaplan-Meier生存曲线分析对照组与PTPRN敲除组患者预后的差异。下调PTPRN可提高异种移植小鼠模型的存活率(图5D)。

6.PTPRN通过与热休克蛋白90α家族A类成员1（HSP90AA1）相互作用激活PI3K/AKT途径

在表达FLAG-HA-PTPRN的T细胞中，通过Co-IP和LC-MS/MS确定了PTPRN和HSP90AA1之间的相互作用（图6A）。免疫沉淀和免疫印迹分析结果表明，PTPRN在U87细胞中与HSP90AA1相互作用（图6B）。PTPRN调节PI3K/AKT途径的活性。BEZ被用来逆转PTPRN过量表达诱导的U细胞中PI3K/AKT途径活性的变化（图6C）。用BEZ处理可逆转PTPRN过表达的U胶质瘤细胞的生长和迁移（图6D-G）。

越来越多的证据表明，PTP家族在调节细胞功能的信号级联的启动和进展中起着至关重要的作用，这些信号级联引起了许多人类疾病，如癌症、代谢综合症和自身免疫性疾病。在某些肿瘤中研究了PTPRN的功能和作用机制。这些研究集中在蛋白质或mRNA表达与临床预后的关系，包括肝细胞癌，肺癌和其他神经内分泌肿瘤，卵巢癌。在胶质瘤研究中，ShergalisA等人表明，PTPRN过表达与胶质母细胞瘤患者的总生存率低密切相关。XuP等人通过加权基因共表达网络分析（WGCNA）发现高PTPRN水平是胶质瘤的一个关键预后因素。这些研究表明，PTPRN可能在胶质瘤的发生和发展中发挥重要作用；但是，目前还没有关于PTPRN在胶质瘤体内或体外的相关实验研究。

本研究结果表明，PTPRN的低水平与胶质瘤患者的预后改善有关。临床实验的结果通过细胞表型实验得到了进一步验证。PTPRN的表达与MGMT密切相关。MGMT是一种独特的DNA修复酶。MGMT从DNA中去除O6-MG，保护肿瘤细胞免受烷基化药物的损伤，进而导致肿瘤细胞对替莫唑胺产生耐药性，成为阻碍胶质瘤化疗效果的重要因素。PI3K/AKT途径参与了MGMT的调控。目前，美国食品和药物管理局已批准PI3K抑制剂paxalisib进入快速通道，用于治疗新诊断的MGMT基因启动子未甲基化的胶质母细胞瘤患者，这些患者已完成初步放疗和替莫唑胺治疗。有趣的是，我们探索了PTPRN在胶质瘤细胞中发挥作用的机制。GSEA显示，PI3K/AKT途径也与PTPRN的变化有关。PI3K-Akt途径参与了细胞的生长和凋亡。各种生长因子、激素和细胞因子的激活将导致该通路的进一步激活，导致细胞失去正常分化和凋亡，从而导致肿瘤的发生。值得注意的是，PI3K/AKT诱导β-catenin在细胞核中积累，上调下游基因的表达，并促进上皮-间质转化（EMT）的进展。上皮-间质转化（EMT）是一个生物过程，即上皮细胞通过特定程序转化为具有间质表型的细胞。E-cadherin可以维持细胞间的紧密连接，防止细胞入侵、转移和扩散。N-cadherin是细胞间粘附的主要结构成分，其主要功能是介导细胞粘附和迁移。Snail是一种转录因子，与E-cadherin等启动子区域结合，抑制其转录，促进上皮-间质转化。在我们的实验中，PTPRN促进了N-cadherin和Snail的表达，抑制了E-cadherin的表达，导致了肿瘤的侵袭和转移。

通过质谱和免疫印迹分析证实的Co-IP实验结果表明，PTPRN通过与HSP90AA1相互作用来调节PI3K/AKT通路的活性。HSP90AA1是HSP90家族的成员，是最重要的热休克蛋白之一。HSP90AA1促进特定目标蛋白的成熟、结构维护和适当调节，并调节细胞周期和信号转导。一些研究证明，HSP90AA1与多种恶性肿瘤密切相关。一项大规模、多中心、交叉验证的临床研究证明，血浆HSP90α可作为泛癌生物标志物。HSP90AA1能稳定和激活c-Myc，参与结直肠癌和肝细胞癌的发生。XiaoX等人证明，HSP90AA1通过PI3K/Akt/mTOR途径促进骨肉瘤的自噬。SongKH等人证明Nanog激活的HSP90A/AKT途径是免疫难治性肿瘤的一个潜在目标。因此，我们假设PTPRN与HSP90AA1相互作用，部分激活PI3K/AKT途径。PI3K抑制剂的处理恢复了PI3K/AKT途径的活性和PTPRN敲除的细胞表型。这些发现证实，HSP90AA1/Akt信号通路可能参与了PTPRN诱导的胶质瘤的增殖和转移。

因此，我们认为，PTPRN高表达的胶质瘤患者预后不佳。PTPRN是一个重要的促进增殖和转移的因子。此外，PTPRN可能部分激活PI3K/Akt途径，通过HSP90AA1影响细胞表型。这些结果表明，减少胶质瘤细胞中PTPRN的表达可以作为一种潜在的治疗策略。

Reference：ExpressionandTumor-PromotingEffectofTyrosinePhosphataseReceptorTypeN(PTPRN)inHumanGlioma

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